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影响免疫组化的因素及对策

海辉养猪网 猪群保健 2021年06月13日
一)免疫组化染色假阳性及其对策 

  1 、消除内源酶的影响 在涉及免疫过氧化酶的各种染色中,均用过氧化物酶来标记抗体,酶的作用是催化底物,使显色剂显色,正常组织中也含有一定量的过氧化物酶,其同样也能催化底物显色,而影响免疫组化染色的特异性,因此在加入标记酶前应设法将其灭活,以保证染色反应的特异性。
通常情况下,去除内源酶的方法是先用 3%的过氧化氢溶液作用,但在含有丰富血细胞的标本中,由于血细胞中存在大量具有活性的过氧化物酶,能与过氧化氢产生强烈的反应,产生气泡而破坏组织结构和细胞形态。在 OCT 包埋的冰冻切片中,使用 3%的过氧化氢化溶液亦会产生类似现象。此时可用 3%的过氧化氢甲醇溶液孵育 20 分钟的方法灭活内源性酶。
  灭活内源酶对正确判断含血细胞较多的标本,如骨髓、胎盘、脾等的染色结果十分重要。同样,正常细胞也含生物素,尤以肝、脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的染色中,内源性生物素易结合后继抗体,形成亲和素(或链亲合素) - 生物素复合物,导致假阳性发生。消除这种非特异性着色的方法,是在采用生物素方法染色前,对标本进行亲和素处理,使其结合位点饱和。 

  2 、抗体导致的非特异性着色 高纯度、高效价的抗体是免疫组化染色的关键。出现下列情况时,可能发生非特异性着色。
  ( 1 )因抗原不纯而导致制备的抗体不纯,常见于多克隆抗体。可用亲和层析的方法除去非特异性抗体或应用高纯度的抗原制备抗体,采用单克隆抗体能避免非特异着色。
  ( 2 )标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇,解决的方法只有采用针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体。 

  3 、 消除非特异性背景着色
  非特异性着色最常见的情况是蛋白质(抗体)吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成分上,防止非特异性背景着色的方法之一是在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液,封闭荷电点不给一抗留有吸附余地,以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成分上。最常用的无关蛋白质溶液是所用二抗的同种动物非免疫血清。用产生二抗的同种动物血清,是为了避免二抗与预先加入的蛋白质结合引起假阳性染色。
用来阻断非特异性结合的血清不能有任何溶血现象。红细胞破裂会使其中的过氧化酶与底物作用,产生非抗原特异性的阳性着色。多克隆抗体因其成分复杂,更易造成背景染色。稀释液采用含 1%BAS pH7.4 的 PBS ,同时在洗液中加入 0.05%的吐温 20 ( Tween20 )有助于消除背景染色。 
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